Im letzten Jahr gab es viele Entwicklungen und Neuigkeiten rund um PCR-Tests, in diesen Tagen hat sich ein neuer Ansatz von LMU-Chemikern könnte dazu beitragen, deutlich zu verbessern PCR-Tests Diagnosetests. Die verwendeten Enzyme werden durch Lichtpulse aktiviert.
DNA-Polymerasen und andere DNA-modifizierende
DNA-Polymerasen und andere DNA-modifizierende Enzyme sind essenzielle Werkzeuge in der Biotechnologie und Diagnostik. Sie sind die Schlüsselkomponente für die PCR-Diagnose von COVID-19. So nützlich sie auch sind, DNA-verarbeitende Enzyme haben oft signifikante Defekte.
Einige von ihnen zeigen eine signifikante Aktivität während der Probenvorbereitung, während andere unangenehme Nebenaktivitäten haben. Beides kann zu einem Verlust an Spezifität und Empfindlichkeit führen, was bei einem diagnostischen Test vermieden werden sollte.
Jede Enzymaktivität blockieren
Der Trick dabei ist, jede Art von Enzymaktivität zu blockieren, bis der Assay gestartet wird. Bei PCR-Tests Diagnosetests, wie dem oben genannten COVID-19-Test, ist die Lösung die Entwicklung eines so genannten hot-start-Enzyms, das erst bei Erreichen einer hohen Aktivierungstemperatur Aktivität zeigt.
Der Hauptnachteil dieser Heißstartmethoden ist, dass sie nicht für durch Hitze geschädigte Enzyme verwendet werden können, sagt LMU-Biochemiker Andrés Vera. „Außerdem ist das Layout eines hot-begin-Enzyms mühsam und die mühsame Layoutmethode muss für jedes neue Enzym wiederholt werden, das wir auslegen müssen.“
Professor Philip sagte…
Zusammen mit Merve-Zeynep Kesici von der Gruppe von Professor Philip Tinnefeld am Institut für Chemie der LMU fand Andrés einen Weg, diese Probleme durch die Entwicklung von „hot-start“-Enzymen zu umgehen. Seine lichtauslösenden Enzyme werden blockiert, bis ein Puls ultravioletten Lichts sie reaktiviert. „Lichtgesteuerte Enzyme gibt es schon lange, aber was unseren Ansatz einzigartig macht, ist, dass er auf praktisch jedes DNA-Verarbeitungsenzym angewendet werden kann. In der Vergangenheit brauchten Sie immer sehr detaillierte Informationen über die Wirkungsweise des Enzyms, und auch Sie waren in keiner Weise positiv gewesen, wenn Sie Ihnen eine intelligente Art und Weise zur Verfügung stellen, das Enzym zu dämmen und mit Licht zu reaktivieren“, sagt Vera, die Unternehmensleiterin.
die Forscher sprachen über PCR-Tests
In ihrem Ansatz fügten die Forscher dem Enzym selbst ein Stück DNA zu, das übermäßig mit jedem anderen Enzymsubstrat konkurriert und das Enzym inaktiv macht (einschließlich seiner sekundären Aktivitäten).
Der Lichtimpuls wird verwendet, um die an das Enzym gebundene DNA zu schneiden, wodurch ein 100% aktives Enzym entsteht. Der Hauptvorteil ist, dass der Mechanismus für eine breite Palette von DNA-bindenden Enzymen unabhängig von ihrer spezifischen Wirkungsweise funktionieren sollte.
Um dies zu demonstrieren, produzierten die Forscher vier lichtaktivierbare Versionen verschiedener DNA-verarbeitender Enzyme. Unter ihnen war die so genannte Phi29-DNA-Polymerase, ein Enzym, das weithin zur Amplifikation ganzer Genome verwendet wird, aber zu hitzeempfindlich, um für Warmstartmethoden geeignet zu sein.
Darüber hinaus zeigte das Team eine Light-Start-PCR und zeigte, dass ihre DNA-Polymerasen im Vergleich zu kommerziellen Hot-Start-PCR-Enzymen gleich gut oder besser waren.
Philip Tinnefeld sprach über PCR-Tests
Philip Tinnefeld begrüßt diese neue Entwicklung: „Dies wird definitiv dazu beitragen, bessere Enzyme für die Biotechnologie und die Diagnostik zu produzieren. Darüber hinaus sind bereits bestehende Echtzeit-PCR-Maschinen mit Lichtquellen ausgestattet und können jederzeit leicht modifiziert werden, um diese Enzyme auf den Markt zu bringen.
