Polymerase Kettenreaktion ASO PCR

Polymerase-Kettenreaktion (ASO-PCR)

ASO-PCR (alternative Methode zum Nachweis von Mutationen)

Einführung

Allelspezifisches Oligonukleotid Polymerase-Kettenreaktion (ASO-PCR) ist eine alternative Methode zum Nachweis von Mutationen.

Der Vorteil der ASO-PCR ist, dass es sich um eine schnelle, einfache und nicht radioaktive Methode handelt.

Zunehmend werden viele Substitutionen einzelner Basenpaare entdeckt, die zu Erbkrankheiten, Prädisposition für genetische Störungen und Krebs führen.

Die Fähigkeit, spezifische DNA-Sequenzen durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu vervielfältigen, hat es ermöglicht, viele Erbkrankheiten schnell und genau zu diagnostizieren.

Vor dem Einsatz der PCR wurden Punktmutationen durch Klonierung und direkte Sequenzierung identifiziert.

Auch südliche Befleckung (Southern Blotting) und Hybridisierung mit markierten Oligonukleotid-Sonden, die auf die Mutationsstelle zentriert sind, oder Verdauung mit Restriktionsendonukleasen.

Diese Methoden wurden durch die PCR erheblich verbessert, das die Amplifikation von DNA-Fragmenten mit polymorphen Stellen aus kleinsten DNA-Mengen ermöglicht.

Diese Techniken sind jedoch in der Regel zeitaufwändig, komplex und erfordern die Verwendung eines radioaktiven Markers, im Falle des Restriktionsendonuklease-Nachweises nur anwendbar sind, wenn die Mutation eine bekannte Exzisionsstelle verändert.

Was ist ASO-PCR?

Ein allelspezifisches Oligonukleotid (ASO) ist ein kurzes Stück synthetisches DNA-Material, das komplementär zur Sequenz einer variablen Ziel-DNA ist.

Es dient als Screening auf das Vorhandensein des Targets in einem Southern Blot Assay oder, häufiger, im einfacheren Punktblot-Assay. Es ist ein gängiges Werkzeug in der Genetik-Test, forensische und Molekularbiologie Forschung verwendet.

Ein ASO ist typischerweise ein Oligonukleotid 15-21 Nukleotidbasen in der Länge. Es ist so konzipiert (und verwendet), dass es spezifisch für eine einzelne Version oder Allel der getesteten DNA ist.

Die Länge des ASO, welcher Strang gewählt wird und die Bedingungen, unter denen er an die Ziel-DNA gebunden (und daraus gewaschen) wird, spielen in seiner Spezifität eine Rolle.

Diese Sonden können in der Regel so ausgelegt sein, dass sie eine Differenz von nur 1 Base in der Zielgensequenz detektieren, eine Kernkompetenz im Einzelnukleotid-Polymorphismus-Assay (SNP), der für die Genotypisierung und die Analyse des Humangenomprojekts wichtig ist.

Um nach der Bindung an das Ziel nachgewiesen zu werden, muss das ASO mit einem radioaktiven, enzymatischen oder fluoreszierenden Tag markiert werden.

Die ASO-Technologie nutzt die Fähigkeit, Basenpaarunterschiede (Cytosin versus Thymin) zu erkennen, um die Methylierung an einer bestimmten CpG-Stelle zu messen.

Was bedeutet das ASO-PCR?

Allelspezifisches Oligonukleotid Polymerase-Kettenreaktion (ASO-PCR) ist eine alternative Methode zum Nachweis von Mutationen in dem nur das perfekt abgestimmte Oligonukleotid als Primer für die Amplifikation wirken kann. Der Vorteil von ASO-PCR ist, dass es sich um eine schnelle, einfache und nicht radioaktive Methode handelt.

ASO-PCR, auch bekannt als Amplification Refraktory Mutation System (ARMS), wurde zunächst zum Nachweis von Mutationen im α1-Antitrypsin-Gen beschrieben.

Seitdem wurde sie bei der Untersuchung mehrerer Gene eingesetzt, darunter die pränatale Diagnose von Mukoviszidose, Apolipoprotein-E-Polymorphismen und Punktmutationen im Ras-Onkogen.

Bei dieser Technik sind Oligonukleotidprimer komplementär zur normalen (Wildtyp-) oder Mutantensequenz ausgelegt und beide werden zusammen mit einem gemeinsamen Primer verwendet.

Da die DNA-Polymerase keine 3′-Exonuklease-Aktivität besitzt, ist sie nicht in der Lage, eine Single-Base-Inkongruenz zwischen Primer und Template am 3′-Ende der DNA-Primer zu reparieren.

Wenn Oligonukleotid-Primer so konzipiert sind, dass sie Fehlanpassungen in der Nähe des 3′-Endes oder am 3′-Ende enthalten, wird der Primer verlängern oder nicht verlängern, je nachdem, welche alternativen Einzelbasen-Polymorphismen in der Zielsequenz vorhanden sind.

Unter den entsprechenden stringenten Bedingungen wird daher nur Ziel-DNA amplifiziert, die exakt komplementär zum Primer ist.

Im Folgenden wird ein einfaches Protokoll für allelspezifische Nukleotid-PCR gezeigt.

Wie er funktioniert?

Die allelspezifische Polymerase-Kettenreaktion (ASPCR) ist eine Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die den direkten Nachweis einer Punktmutation in menschlicher DNA durch Analyse von PCR-Produkten auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarose- oder Polyacrylamidgel ermöglicht.

Pionier

Pionierarbeit leistete er bei der Verwendung synthetischer Oligonukleotide als spezifische Sonden für Sequenzvariationen. Genetik von R. Bruce Wallace, am City of National Hope Medical Center in Duarte, Kalifornien.

1979 berichteten Wallace und seine Mitarbeiter über den Einsatz von ASO-Sonden zum Nachweis von Variationen in einem einzelsträngigen bakteriellen Virus und wandten die Technik anschließend zum Klonen menschlicher Gene an.

In den Jahren 1983 und 1985 berichtete das Labor von Wallace über einen Mutation-Nachweis für Sichelzellenanämie in „ganzen genomischen DNA“-Proben, obwohl diese Anwendung durch die geringe Anzahl von Tags, die von ASO getragen werden konnten, behindert wurde.

Glücklicherweise wurde 1985 auch über PCR berichtet, eine Methode zur starken Amplifikation eines bestimmten DNA-Segments.

In weniger als einem Jahr wurde die PCR mit der ASO-Analyse kombiniert. Diese Kombination löste das Problem der ASO-Kennzeichnung, da die Menge der Ziel-DNA über eine bereits vorhandene erweitert werden konnte.

Auch könnte die Spezifität des PCR-Prozesses selbst zu der der ASO-Sonden hinzugefügt werden, Verringerung des Problems der falschen Bindung des ASO an Nicht-Zielsequenzen.

Die Kombination war so spezifisch, dass sie in einer einfachen Dot-Blot-Weise verwendet werden konnte, Vermeidung der mühsamen und ineffizienten südlichen Weiß/Schwarz-Blot-Methode.

PCR auf der Grundlage des Allelspezifisches Oligonukleotid-Tests (ASO)

Neue DNA-Sequenzierung einer Reihe von Fischen identifiziert: einen Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP), der zwei Allelen (A und B) eines einzigen Gens entspricht (oben, Mitte).

Es werden zwei PCR-Primer konstruiert, die für die SNP-Allele A bzw. B spezifisch sind.

Diese allelspezifischen Oligonukleotide (ASOs) werden mit einem Ankerprimer für eine allen Fischen gemeinsame DNA-Sequenz (oben, rechts) gepaart.

Der Fortschritt der PCR wird in „Echtzeit“ überwacht und eine erfolgreiche Reaktion zeigt das Vorhandensein des entsprechenden SNP-Allels an.

ASO PCR

Anwendung auf die Aquakultur

Ein Fischzüchter möchte wissen, ob einige der Fische (Männchen), die in einem Massenlaichversuch verwendet werden, unverhältnismäßig zum Genpool der nächsten Generation beitragen.

Sie wählt zwei Männchen aus, die homozygot für SNP A bzw. B sind, und ein unmarkiertes Weibchen (oben, links).

Die drei Fische können zufällig laichen; 48 Larven werden selektiert (unten links).

ASO A und B Tests werden gleichzeitig auf allen Larven in einem 96-Well-Plattenformat, in abwechselnden Reihen (unten, rechts) durchgeführt.

Hier haben nur 8 der 48 Larven das B-Allel, was auf einen fünffachen Fortpflanzungsvorteil des A-Elternteils hinweist.

Anwendung der biologischen Vielfalt

Ein Fischereimanager möchte wissen, wie viele Fischeier von zwei verschiedenen Arten ähnlicher Größe im Plankton vorhanden sind.

Sie identifiziert eine Region, in der sich die beiden Spezies durch ein einziges SNP unterscheiden, das die Allele A bzw. B produziert (oben, links).

A- und B-spezifische ASOs werden konstruiert (oben rechts).

Aus jedem der 48 Eier wird DNA extrahiert (unten links), und die A- und B-ASOs werden auf jedem Ei gleichzeitig in einem 96-Well-Plattenformat in abwechselnden Reihen (unten rechts) ausgeführt.

Hier haben nur 8 der 48 Larven das B-Allel, was auf eine fünffache Menge der A-Spezies im Vergleich zur B-Spezies hinweist.

Dieses „RT-PCR ASO“-Verfahren ist eine Alternative zu den herkömmlichen Anforderungen an elektrophoretische Assays und ermöglicht ein schnelles, großflächiges Screening von Larvenpopulationen und Kohorten.

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References

Studencki AB, Conner BJ, Impraim CC, Teplitz RL y Wallace RB „Discrimination between human beta A, beta S and beta C globin genes using allele-specific oligonucleotide hybridisation probes“. Am J Hum Genet vol. 37 (1), págs. 42-51 (1985).
^ a B Saiki, RK; Scharf S; Faloona F; Mullis KB; Horn GT; Erlich HA; Arnheim N (20 de diciembre de 1985). „Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for the diagnosis of sickle cell disease.“. Ciencias. 230 (4732): 1350–4. Bibcode:1985 Sci … 230.1350S. doi:10.1126 / science.2999980. PMID 2999980. Archivado desde el original el 19 de diciembre de 2008.
^ Wallace, RB; Shaffer, J; Murphy, RF; Bonner, J; Hirose, T; Itakura, K (1979). „Hibridación de oligodesoxirribonucleótidos sintéticos con ADN Phi-X 174: el efecto del desajuste de un solo par de bases“. Investigación de ácidos nucleicos. 6 (11): 3543–3558. doi:10.1093 / nar / 6.11.3543. PMC 327955. PMID 158748.
^ Conner BJ, Reyes AA, Morin C, Itakura K, Teplitz RL y Wallace RB „Detección del alelo de la beta S-globina de células falciformes por hibridación con oligonucleótidos sintéticos“. Proc Natl Acad Sci USA. vol. 80 (1), págs. 278-282 (1983).
^ Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB y Erlich HE „Análisis de ADN de beta-globina y HLA-DQ amplificado enzimáticamente con sondas de oligonucleótidos específicos de alelo“ Nature vol. 324 (6093) págs. 163-166 (1986).

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