Ergänzende DNA (cDNA)

Ergänzende DNA (cDNA) ist eine doppelsträngige DNA Modell eines mRNA-Moleküls. In höheren Eukaryonten ist eine mRNA ein nützlicherer Prädiktor einer Polypeptidsequenz als eine genomische Sequenz, weil die Introns miteinander gespleißt wurden.
Die Forscher bevorzugen die Verwendung von cDNA anstelle von mRNA selbst, weil RNAs von Natur aus weniger stabil sind als DNA und es keine Techniken gibt, einzelne RNA-Moleküle routinemäßig zu amplifizieren und zu reinigen.

Komplementäre DNA wird aus mRNA unter Verwendung eines einzigartigen Enzyms hergestellt, das als entgegengesetzte Transkriptase bekannt ist und zunächst von Retroviren entfernt wird. Mit einem mRNA-Molekül als Template synthetisiert reverse Transkriptase ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das als Template für die Synthese von doppelsträngiger DNA verwendet werden kann.

Was ist cDNA?

Komplementäre DNA ist eine Kopie der DNA, die von Prokaryonten oder Eukaryonten stammen kann. Es wird in der Gentechnik verwendet, um Klone verschiedener Gene zu liefern. cDNA wird aus mRNA durch ein Enzym namens reverse Transkriptase synthetisiert.

Im Zellleben wird komplementäre DNA durch Viren und Retrotransposons zur Integration von RNA in die Ziel-Genom-DNA erzeugt. In der Molekularbiologie wird RNA nach Abspaltung von genomischer DNA, Proteinen und verschiedenen Zellkomponenten vom Ausgangsgewebe gereinigt.

Die Synthese von komplementärer DNA aus RNA ist ein wichtiger erster Schritt in vielen molekularen Anwendungen. Genexpressionsanalyse, Pathogendetektion und genetische Tests durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) oder Next-Generation-Sequencing (NGS) sind nur einige Beispiele für Anwendungen, die als ersten Schritt die Transkription von RNA in komplementäre DNA erfordern.

Die Erzielung genauer und präziser Ergebnisse bei diesen Anwendungen erfordert eine hochgenaue cDNA-Synthese, sodass die cDNA-Bibliothek die ursprünglichen RNA-Transkripte genau darstellt.Zwei kritische Bedenken bei der Entscheidung über ein cDNA-Synthesepaket sind das entgegengesetzte Transkriptase-Enzym und der Priming-Ansatz, der zur Provokation der Reaktion verwendet wird. Die Wahl des Enzyms beeinflusst die Synthesegeschwindigkeit und die Reaktionsgenauigkeit. Priming-Strategien beeinflussen, was in der Reaktion transkribiert wird und, wenn suboptimal, kann in einer voreingenommenen Bibliothek, die nicht genau das gesamte Transkriptom.

cDNA-Synthese-Kits bieten eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, cDNA aus RNA-Proben herzustellen. Diese praktischen, gebrauchsfertigen Kits beinhalten die notwendigen Komponenten für Reverse Transkription, Reverse Transkriptase (RT), dNTPs, Reaktionspuffer, Nuclease-freies Wasser und RNase-Inhibitoren. Optimierte Protokolle und hochwertige Reagenzien können dazu beitragen, unbefriedigende cDNA-Ausbeuten aufgrund niedriger RNA-Konzentration, Zielgenkomplexität oder Reagenzinkonsistenzen zu beheben.
Zur Herstellung der Reaktion werden üblicherweise Oligo(dT) oder statistische Hexamere (oder beide) eingeschlossen. Bei der Auswahl eines cDNA-Synthese-Kits sind die Größe des transkribierten Fragments, die Kompatibilität mit nachgeschalteten Anwendungen und die Anzahl der Reaktionen pro Kit zu berücksichtigen.

1. Complementary DNA
2. Encyclopedia of Genetics, 2001
3. Tavares, Lucélia; Alves, Paula M.; Ferreira, Ricardo B
4. The Journal of Molecular Diagnostics