Western Blot (Immunoblot)

Western Blotting oder Immunoblotting ist eine analytische Technik, die in der Zell- und Molekularbiologie verwendet wird, um spezifische Proteine in einer komplexen Mischung von Proteinen zu identifizieren, wie sie in Zell- oder Gewebeextrakten vorkommen. Die Technik verwendet drei Schritte, um dies zu erreichen: Trennung nach Größe, Übertragung auf ein festes Medium und schließlich Visualisierung. durch Proteinmarkierung unter Verwendung geeigneter primärer oder sekundärer Antikörper.

Western Blotting ist eine Labortechnik, die verwendet wird, um ein bestimmtes Protein in einer Blut- oder Gewebeprobe zu entdecken. Die Methode beinhaltet den Gebrauch der Gelelektrophorese, um Proteine von der Probe zu trennen. Die abgetrennten Proteine werden vom Gel auf die Oberfläche einer Membran übertragen. Die Membran wird einem spezifischen Antikörper gegen das zu untersuchende Protein ausgesetzt. Die Bindung des Antikörpers wird mit einem radioaktiven oder chemischen Marker nachgewiesen. Ein Western Blot wird manchmal zur Diagnose von Krankheiten verwendet.

Western Blotting (auch Immunoblotting genannt) ist eine Technik, die für die Analyse von einzelnen Proteinen in einer Mischung von Proteinen (z. B. ein Zelllysat) verwendet wird.

Beim Western Blotting (Immunoblot) wird das Proteingemisch auf eine Gelelektrophorese auf einer Trägermatrix (SDS-PAGE, natives PAGE, isoelektrische Fokussierung, 2D-Gelelektrophorese usw.) aufgebracht, um die Proteine nach Größe, Ladung oder anderen Unterschieden in den einzelnen Proteinbändern zu sortieren.

Die getrennten Proteinbänder werden dann auf eine Trägermembran übertragen (z. B. Nitrocellulose, Nylon oder PVDF). Dieser Prozess wird als Blotting bezeichnet. Die Proteine haften an der Membran im gleichen Muster, in dem sie wegen der Ladungsinteraktionen getrennt worden sind.

Die Proteine in diesem Immunoblot sind dann für Antikörperschwergängigkeit für Befund zugänglich.

Antikörper werden verwendet, um Zielproteine im Western Blot (Immunoblot) nachzuweisen. Die Antikörper werden mit fluoreszierenden oder radioaktiven Markierungen oder Enzymen konjugiert, die zu einer nachfolgenden Reaktion mit einem aufgebrachten Reagenz führen, was zu einer Färbung oder Lichtemission führt, die den Nachweis ermöglicht.

Der Begriff Western Blotting basiert auf einem Wortspiel. Southern Blotting, eine Methode zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen, ist nach Ed Southern benannt, der dieses Verfahren als erster beschrieb.

Der Western Blot (Immunoblot) sowie der Northern Blot (zur RNA-Detektion) spielen mit der Bedeutung dieses Namens.

Gelelektrophorese  ist eine Technik, die verwendet wird, um Fragmente der DNS (oder anderer Makromoleküle, wie RNS und Proteine) durch Größe und Ladung zu trennen. Bei der Elektrophorese wird ein Strom durch ein Gel geleitet, das die gewünschten Moleküle enthält. Aufgrund ihrer Größe und Ladung bewegen sich die Moleküle in verschiedene Richtungen oder mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Gel und trennen sie so voneinander.

• Gelelektrophorese ist eine Technik, die verwendet wird, um DNS-Fragmente entsprechend ihrer Größe zu trennen.
• DNA-Proben werden in Vertiefungen (Schlitze) an einem Ende eines Gels geladen und mit elektrischem Strom durch das Gel gezogen.
• Die Fragmente sind negativ geladen, so dass sie sich in Richtung der positiven Elektrode bewegen. Da alle DNA-Fragmente die gleiche Ladungsmenge pro Masse haben, passieren kleinere Fragmente das Gel schneller als größere.
• Wenn ein Gel mit einem Pigment gefärbt wird, das an DNA bindet, können DNA-Fragmente als Bänder gesehen werden, die eine Gruppe von DNA-Fragmenten der gleichen Größe darstellen.

Verschiedene Arten der Gelelektrophorese für Proteine können abhängig von den Kriterien gewählt werden, durch die die Proteine getrennt werden sollen. Einige häufig verwendete elektrophoretische Methoden sind: SDS-PAGE, native-PAGE und isoelektrische Fokussierung.

Hierbei handelt es sich um eine Denaturierungsmethode, da die Proteine mit einem anionischen Detergenz SDS (Natriumdodilsulfat) behandelt werden. Die Sekundär- und Tertiärstruktur wird dabei zerstört. Darüber hinaus bindet das SDS an die Proteine und deckt so ihre chemischen Ladungen ab, wodurch die Proteine gleichermaßen negativ geladen werden.

Daher erfolgt die nachfolgende Trennung nur durch die Größe der Polypeptidketten im Polyacrylamidgel.

Mit dieser Methode können native, nicht gefalzte und nicht emaillierte Proteine getrennt werden. Diese Methode ermöglicht die Trennung von Proteinen, die mit anderen Methoden nicht zugänglich sind. Ein Beispiel wäre die Trennung von modifizierten und unveränderten Proteinen des gleichen Typs (z. B. phosphorylierter versus nicht-phosphorylierter Zustand eines Proteins). Native PAGE kann auch verwendet werden, um biologisch relevante Konformationen wie di-, tri- oder tetramere Proteinformen zu bestätigen (im Gegensatz zu SDS-PAGE, das einzelne, denaturierte Peptidketten trennen würde). Diese Methode kann auch verschiedene Komplexe verschiedener Proteine nachweisen.

Die Trennung durch „Native PAGE“ hängt von einer Reihe von Parametern wie Ladung, Größe und 3D-Struktur des Proteins ab. Ein geeigneter Puffer wird benötigt, um die 3D-Faltung des Proteins aufrechtzuerhalten. Die Anwendbarkeit des Puffers hängt von der isoelektrischen und Proteinbelastungen.

Diese Methode basiert auf der Tatsache, dass ein Protein bei bestimmten pH-Werten eine bestimmte Ladung aufweist. Je nach pH-Wert tragen saure und basische funktionelle Gruppen dazu bei, die Gesamtladung des Proteins zu erhöhen oder zu verringern. Der isoelektrische Punkt wird als der Punkt definiert, an dem die Gesamtladung des Moleküls Null ist, weil es eine gleiche Menge von negativen und positiven Ladungen auf dem Molekül gibt.

Für die isoelektrische Fokussierung werden spezielle Gradientengele benötigt, da sich der pH-Wert entlang eines Gradienten innerhalb des Gels von sauer zu basisch ändert. Aufgrund einer elektrischen Ladung, die am Gel befestigt ist, bewegt sich das Protein zu dem Punkt im Gel, an dem die Ladung des Gels gleich der des Proteins ist, und die Gesamtladung ist gleich Null, dh der isoelektrische Punkt. Daher wird diese Methode verwendet, um Proteine durch ihre Ladungen zu trennen, sowie um den isoelektrischen Punkt eines Zielproteins zu bestimmen. Die Trennung erfolgt durch die Ladung des Proteins oder durch die Anzahl der im Protein enthaltenen basischen und sauren Gruppen.

Die oben genannten Methoden für Proteingelelektrophorese können auch kombiniert werden, um Proteine zu trennen. Die Wahl der Methoden hängt von den spezifischen Anforderungen des Experiments ab.

Nach der Trennung des Proteingemisches werden die Polypeptidbänder auf einen Membranträger übertragen. Dazu wird die Membran auf das Gel geklebt und dieses sogenannte Sandwich in eine Elektrophoresekammer überführt. Es ist möglich, dass ein Teil des SDS entfernt und das Protein teilweise neu gesättigt wird, d. h. es gewinnt seine 2D- und 3D-Struktur zurück. Die aufgebrachte elektrische Ladung bewirkt jedoch, dass sich die Proteine vertikal in der Richtung, in der sie sich im Gel bewegten, auf die Membran bewegen. Auf diese Weise binden die Proteinbänder an die Membran. Die „gelöschten“ Bänder stehen nun zur Weiterverarbeitung zur Verfügung (z. B. zum Nachweis spezifischer Proteine mit spezifischen Antikörpern).

Die Identifizierung spezifischer Antikörper ist nach Abtrennung und Blot der Proteine möglich. Spezifische Antikörper (monoklonal oder polyklonal) binden an ‚ihr‘ Proteinband. Unspezifische bindende Antikörper werden durch Waschen mit waschmittelhaltigen Puffern entfernt. Darüber hinaus können die unspezifischen Bindungstaschen blockiert werden, bevor spezifische Antikörper hinzugefügt werden.

In der Regel werden zuerst primäre Antikörper appliziert, die dann von einem sekundären Antikörper erkannt werden. Der sekundäre Antikörper wird mit Farbe, Radioaktivität oder einem Enzym zum Nachweis konjugiert. Zu diesem Zweck werden auch Biotin-konjugierte Antikörper verwendet.

Die Western-Blot-Methode (Immunoblot) hat gegenüber anderen Immuno-Sorbent-Assays (ISA) wie ELISA mehrere Vorteile.

Western Blotting (Immunoblotting) erweitert die Idee des ELISA, indem es die Trennung der Proteinmischung nach Größe, Ladung und/oder Konformation ermöglicht. Das beschriebene Stripping-Verfahren erlaubt den Nachweis mehrerer Targets, im Gegensatz zum ELISA, bei dem nur ein Protein nachgewiesen werden kann.

Da Proteingelelektrophorese Proteine in Bänder trennt, kann die Größe des Zielproteins/Polypeptids bestimmt werden. Es ist auch möglich, das Protein von Interesse (semi-) zu quantifizieren, indem ein interner Mengenstandard parallel zu den Proben auf dem Gel ausgeführt wird.

Der Proteingehalt der Proben kann auch verglichen werden („Probe A enthält mehr Protein als Probe B“).

Ein Nachteil von Western Blot (Immunoblot) ist, dass es zeitaufwendig ist (im Vergleich zu ELISA) und eine hohe Nachfrage in Bezug auf die Expertise der Experimentatoren hat.

Darüber hinaus erfordert es eine Optimierung der experimentellen Bedingungen (z. B. Proteinisolierung, Puffer, Art der Trennung, Gelkonzentration usw.)..

Es gibt viele verschiedene Arten und Methoden des Western Blotting (Immunoblotting). Daher deckt es sehr unterschiedliche Themen und Anwendungen ab.

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