Die Isolierung von Plasmid-DNA oder „plasmid dna isolation“ aus Mikroorganismen ist ein kritischer Ansatz in der Molekularbiologie und ein entscheidender Schritt in vielen Prozessen, die Klonierung, DNA-Sequenzierung, Transfektion und Gentherapie umfassen. Diese Verfahren erfordern die Isolierung von hochreiner Plasmid-DNA. Die gereinigte Plasmid-DNA kann sofort in allen molekularbiologischen Verfahren wie Restriktionsenzymverdau, Klonierung, PCR, Transfektion, in vitro Translation, Blotting und Sequenzierung verwendet werden.
Schritte zur Plasmid-DNA-Extraktion
- Anbau der Bakterienproben
- Setzen Sie die pelletierten Zellen in der Pufferlösung fort.
Anschließend werden die Zellen in einer isotonischen Lösung resuspendiert, die Tris, EDTA (zur Destabilisierung der Zellwand und zur Verhinderung von Plasmidschäden), Glucose (zur Verhinderung von Zellbersten) und RNase A (zur Abbauung der zellulären RNA während der Zelllyse) enthält.
- Lyse der Zellen
Anschließend wird eine alkalische Lösung zugegeben, die Natriumhydroxid und Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, um die Zelllyse und Denaturierung der genomischen und Plasmid-DNA zusammen mit allen Proteinen in der Lösung zu erleichtern. Die hochalkalische Lösung aus NaOH und SDS reißt Zellmembranen auf und wandelt doppelsträngige DNA (dsDNA) in einzelsträngige DNA (ssDNA) um.
- Neutralisieren der Lösung mit Kaliumacetat
- Fällt die Plasmid-DNA mit Ethanol aus.
Schließlich müssen Sie die Plasmid-DNA nach einem Verfahren isolieren, das als Ethanol-Präzipitation bekannt ist. Nach dem Ausfällen spülen Sie den Niederschlag (die Plasmid-DNA) in kaltem 70%igem Ethanol und lassen ihn etwa 10 Minuten trocknen, bis der Alkohol verdampft. Sie sollten auch das DNA-Pellet in einer Pufferlösung, die Tris-, EDTA- und RNasen enthält, resuspendieren, um die verbleibende RNA in der Lösung zu entfernen.
Tipps zur Plasmid-Isolierung
Die Plasmid-Isolierung kann schwierig sein, daher sollten Sie die folgenden Tipps beachten, wenn Sie Plasmid-DNA extrahieren:
Führen Sie die Zelllyse schnell durch, um eine irreversible Plasmiddenaturierung zu vermeiden. Resuspendierungs- und Lysepuffer sollten gut gemischt werden, daher sollten sie nicht energisch kombiniert werden, um zu vermeiden, dass die DNA in kleinere Fragmente zerbrochen wird. Wenn sie klein genug sind, kann gebrochene gDNA wieder zusammenkommen und in Lösung bleiben. Tragen Sie Handschuhe und eine geeignete Augensicherheit bei der Arbeit mit harten chemischen Verbindungen zusammen mit NaOH und SDS.
Grundsatz
Die Reinigung von Plasmid-DNA aus bakterieller DNA beruht auf der differenziellen Denaturierung von chromosomaler und Plasmid-DNA durch alkalische Lyse zur Trennung der beiden.
Die primären Schritte der Plasmidisolierung sind die Zerlegung der mobilen Form zu einem Lysat, die Abtrennung des Plasmids von der chromosomalen DNA, mobile Partikel und unterschiedliches unlösliches Material. Bakterien werden mit einem Lysepuffer, der Natriumdodecylsulfat (SDS) und Natriumhydroxid enthält, lysiert oder verarbeitet. Während dieses Schrittes werden maximal die Zellen aufgebrochen, chromosomale und Plasmid-DNA denaturiert und das nachfolgende Lysat durch Zentrifugation, Filtration oder Magnetstrippen gereinigt.
Die anschließende Neutralisation mit Kaliumacetat lässt die kovalent verriegelte Plasmid-DNA am wirksamsten wieder zusammenführen und weiter solubilisiert werden. Der größte Teil der chromosomalen DNA und Proteine fällt kompliziert mit Kalium und SDS aus, das durch Zentrifugation eliminiert wird.
Welche Lösung wird zur plasmid dna isolation verwendet?
Diese Lösung enthält Natriumhydroxid und SDS (Natriumdodecylsulfat). Natriumhydroxid denaturiert Plasmid und chromosomale DNA in einzelne Stränge.