gene knockout

Gene Knockout 2022

Gene Knockout, auch Geninaktivierung genannt, ist eine genetische Technik, bei der die Expression eines bestimmten Gens in einem Organismus unterdrückt wird, indem das ursprüngliche Gen an seinem genetischen Ort durch eine modifizierte Version des Gens ersetzt wird, in dem ein oder mehrere Exons gelöscht wurden, Dies führt zu Organismen, die das Gen nicht in einem bestimmten Gewebe oder im gesamten Organismus exprimieren. Diese Organismen werden auch Knockouts genannt.

Ein Knockout ist identisch mit dem obigen, aber anstatt ein bestimmtes Gen zu löschen, ersetzt es es durch eine veränderte Version des Gens, das eine zusätzliche Funktion erzeugt.

gene knockout Übersicht

Gen-Blocking-Technologien werden verwendet, um die Genome aller lebenden Organismen zu verändern. Wenn eine Mutation die Funktion eines Gens inaktiviert, wird sie als gene knockout bezeichnet. Gen-Knockout-Methoden werden verwendet, um die Funktion eines bestimmten Gens zu kennzeichnen, indem sie die Funktion dieses Gens hemmen.

Dieses Verfahren wird sowohl in der klassischen Genetik als auch in modernen Techniken wie der funktionellen Genomik eingesetzt. Anfangs wurde das Gen-Knockout durch Transposon-Mutagenese durchgeführt. Der Hauptnachteil dieser Methode ist das langwierige Screening, um das neutralisierte Gen zu finden. Die Löschung anderer Organismen wurde mit Hilfe der Gentechnik erreicht.

In-vitro-Techniken werden verwendet, um Gene in Plasmiden oder bakteriellen künstlichen Chromosomen (BACs) zu modifizieren, und diese modifizierten Konstrukte werden dann mit Zellkulturtechniken auf den betreffenden Organismus übertragen. Andere Methoden verwenden eine Kombination von Gentechnik und homologer Rekombination in vivo, jedoch ist diese Kombination nicht so effektiv.

Die homologe Rekombination ist das ultimative Werkzeug zur Herstellung von Gen-Knockouts. Es ermöglicht die direkte Deklaration des bakteriellen Chromosoms oder die Modifikation von Plasmid oder BAC in vivo als Vorläufer. Diese Technik stützt sich nicht auf Beschränkungsstellen. Eine Medikamentenkassette kann überall in einem Gen platziert werden oder das offene Lesen des Gens kann durch die Medikamentenkassette ersetzt werden. In beiden Fällen wird das gewünschte Konstrukt ausgewählt.

gene knockout Methode

Verschiedene molekularbiologische Techniken stehen zur Verfügung, um die Genexpression zu beeinflussen. Diese Techniken unterscheiden sich in den verwendeten Instrumenten, der Zeit, um ein positives Ergebnis zu erzielen und der Spezifität des Ergebnisses. Zu diesen Techniken gehören:

  • homologe Rekombination: das ursprüngliche Gen wird durch eine mutierte Version ersetzt. Diese mutierte Version kann fast die gesamte Gensequenz eliminieren oder die Expression des ersten Exons verlassen. Es dauert in der Regel mehrere Monate, um modifizierte Individuen zu erhalten (vor allem bei Mäusen), obwohl sie den Vorteil haben, sehr spezifisch zu sein: Diesen Organismen fehlt nur das Zielgen.
  • Transgenese, Das besteht aus der Einführung von Sequenzen in das ursprüngliche Gen, das es modifiziert, um Änderungen zu erzeugen, die zu nicht-funktionellen Proteinen führen. Dies ist eine im Allgemeinen schnellere Technik, deren Nachteil darin besteht, dass das endogene Gen noch vorhanden ist und ein Protein produzieren kann, sogar ein mutiertes, das andere Moleküle in dem Stoffwechselweg beeinflussen kann, zu dem es gehört. Darüber hinaus kann eine neue Mutation zufällig auftreten und die eingeführte Modifikation rückgängig machen, indem das ursprüngliche Protein wieder produziert wird, was nicht ungewöhnlich ist.
  • Mutagenese. Mutanten können mit einem mutagenen Produkt (z. B. EMS) erhalten werden, das zufällige Mutationen erzeugt. Im Anschluss werden Organismen ausgewählt, die „STOP“-Codons in der gewünschten Reihenfolge tragen. Dies ist eine schnelle Methode zur Gewinnung von Mutanten, obwohl es nicht spezifisch für das Zielgen ist, was zu Rückschlägen führen kann.
  • Abbruch. Las secuDNA-Enzyme, die störende RNA-Moleküle exprimieren, können in das Genom eines Organismus oder direkt in Zellen eingebracht werden. Diese Moleküle stören spezifisch die Expression des Zielgens, was in der Regel zu einer reduzierten Expression führt (aus diesem Grund werden sie auch „Knockdown“ genannt). Diese Technik ist schneller als das Erhalten eines Knock-out-Organismus, aber führt nicht zur vollständigen Beseitigung der Expression, und die eingeführte Sequenz, die die störende RNA kodiert, kann auch Mutationen durchlaufen, die die gewünschte Wirkung inaktivieren.

Genetische Knockout-Technologien

Die beste Annäherung, zum eines Genknockout zu produzieren ist homologe Rekombination. Mit Gen-Knockout-Methoden wird ein einzelnes Gen eliminiert, ohne alle anderen Gene in einem Organismus zu beeinflussen. Bei dieser Methode wird der Organismus, in dem das betreffende Gen nicht mehr funktionsfähig ist, als Knockout-Organismus bezeichnet. Wenn mehr als ein Gen in einem Organismus gelöscht wird, wird es als Double Knock-out oder DKO, Triple Knock-out oder TKO und Quadruple Knock-out oder QKO bezeichnet, abhängig von der Anzahl der Gene.

gentechnischer Methoden

Gene Knockout wird mit Elementen wie Plasmiden, DNA-Konstrukten oder künstlichen Bakterienchromosomen durchgeführt.
Der Gen-Knock-out-Prozess produziert in der Regel transgene Tiere, bei denen das Zielgen verändert wurde. Um transgene Tiere zu erzeugen, werden embryonale Stamm- oder ES-Zellen genetisch verändert und im nächsten Schritt werden die transformierten ES-Zellen in frühe Embryonen eingefügt.

Die so erzeugten transformierten Tiere haben die Fähigkeit, das transformierte Gen an nachfolgende Generationen weiterzugeben.

Theorie des gene knockout

Rekombination wird als Gentechnik definiert, die durch homologe Rekombination in vivo vermittelt wird. Die Rekombination wird mit Hilfe einer Bakteriophage durchgeführt. Bakteriophagen wie λ Red, RecET oder ähnliche Systeme werden am häufigsten verwendet. Rekombination kann auch für Deletionen, Punktmutationen, Duplikationen, Inversionen, Fusionen und Tags verwendet werden. In die Ziel-DNA der Zellen wird ein lineares DNA-Substrat eingebracht, das die gewünschte Modifikation oder Homologien enthält. Die Zellen exprimieren rekombinante Enzyme, die durch das Phage kodiert werden. Diese Enzyme helfen, die lineare DNA in das Zielmolekül zu integrieren. Auf diese Weise entstehen rekombinante Moleküle. Das am häufigsten verwendete Rekombinationssystem ist das der Bakteriophage λ Red. Dieses System besteht aus den drei Gam-Proteinen Exo Beta. Das Gam-Protein hemmt die E. coli RecBCD-Exonuclease, die normalerweise lineare dsDNA abbaut. Gam ist nicht wesentlich für Rekombination, aber erhöht die Rekombinationsfrequenz von dsDNA bis zum 20-fachen. Exo ist eine Exonuclease, die für 5′ 3′ doppelsträngige DNS spezifisch ist und für dsDNA-Rekombination angefordert wird. Protein Beta, ein DNA-Annexin-Protein, ist die zentrale Rekombinase für die Rekombination.

Wichtig ist, dass die Rekombinationsfunktionen des Wirts, einschließlich des Schlüsselproteins RecA, für die Rekombination nicht erforderlich sind.

Sources

  1. Gene Method
  2. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors
  3. CRISPR

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