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CRISPR | Gentaur

Das Akronym CRISPR steht für sich wiederholende Sequenzen in der DNA von Bakterien, die als Auto-Impfstoffe funktionieren.

Viele menschliche Krankheiten sind genetischer Natur, verursacht durch Veränderungen oder Mutationen in der genetischen Sequenz eines Individuums oder durch abweichende Expression bestimmter Gene. Die Gentherapie zielt darauf ab, das dysfunktionale Gen in einer Zelle zu korrigieren oder zu ersetzen, und die erste erfolgreiche klinische Studie im Jahr 1990 gab vielen Patienten Hoffnung auf eine mögliche Behandlung, wenn frühere Optionen begrenzt oder nicht vorhanden waren. Aber die Gentherapie erlitt einige große Rückschläge: Eine Immunreaktion auf das virale Abgabesystem verursachte den Tod eines Patienten in einer klinischen Studie und mehrere Patienten entwickelten Leukämie aufgrund der Insertion eines Gens in einen onkogenen Locus. Diese tragischen Ereignisse sorgten für erhebliche Sicherheitsbedenken und klinische Studien zur Gentherapie wurden für mehr als ein Jahrzehnt gestoppt.

Was ist „CRISPR“?

CRISPR ist eine Technologie, die verwendet werden kann, um Gene zu modifizieren und als solche das Potenzial hat, die Welt zu verändern.

Die Essenz von CRISPR ist einfach: Es ist eine Möglichkeit, ein bestimmtes Stück DNA in einer Zelle zu finden. Der nächste Schritt bei der CRISPR-Gen-Editierung besteht normalerweise darin, dieses Stück DNA zu bearbeiten. CRISPR wurde jedoch auch für andere Dinge angepasst, wie das Ein- oder Ausschalten von Genen, ohne deren Reihenfolge zu ändern.

Was ist CRISPR-Cas9?

CRISPR-Cas9 ist ein Genom-Editing-Tool, das die wissenschaftliche Welt im Sturm erobert. Es ist schneller, billiger und genauer als bisherige DNA-Editing-Techniken und hat eine breite Palette von möglichen Anwendungen.

CRISPR-Cas9 ist eine einzigartige Technologie, die es Genetikern und medizinischen Forschern ermöglicht, Teile des Genoms durch Löschen, Hinzufügen oder Ändern von Abschnitten der DNA-Sequenz zu modifizieren.
Es ist derzeit die einfachste, vielseitigste und genaueste Methode der genetischen Manipulation und stößt daher auf großes Interesse in der wissenschaftlichen Welt.

Zell- und Gentherapie mit CRISPR

Die Gentherapie zielt darauf ab, Krankheiten zu behandeln, indem sie genetisches Material einführt, um eine Mutation zu korrigieren oder eine funktionelle Kopie eines Gens bereitzustellen. Modifikationen können in vivo, direkt im menschlichen Körper oder ex vivo, außerhalb des Körpers sein. Ein weiterer Ansatz ist die Zelltherapie, bei der ganze Zellen in den Patienten eingebracht werden, wobei Zellen verwendet werden, die vom Patienten selbst oder von gesunden Spendern stammen. In Forschungsanwendungen hat CRISPR-Cas9 aufgrund seiner inhärenten Effizienz und Einfachheit frühere Genbearbeitungstechnologien übertroffen: Anstatt kostspieliges und zeitaufwändiges Protein-Engineering zu erfordern, können Änderungen an genomischen Sequenzen mit einemNukleotid-Anteil einer einzelnen Leit-RNA (sgRNA). Intensive Arbeit ist im Gange, um diese Kraft in die klinische Anwendung zu bringen.

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Die Grenzen von CRISPR überwinden

CRISPR ist zwar ein vielversprechender Ansatz für die Zell- und Gentherapie, hat jedoch mehrere Einschränkungen, einschließlich der Off-Target-Aktivität und der ineffektiven Bearbeitung von DNA-Schäden, der Abgabe und der Toxizität, Aufgrund des raschen Fortschritts der CRISPR-Technologie wurden jedoch bereits mehrere Strategien entwickelt, um diese zu umgehen:

Cas9 modifizieren, um Off-Target-Aktivität zu reduzieren: Eines der Hauptprobleme bei CRISPR ist die Off-Target-Aktivität, d.h. die Einführung eines Edits an einem unerwarteten Punkt. Ein Ansatz zur Reduzierung der Off-Target-Aktivität besteht darin, eine modifizierte ‚Nickase‘ Cas9 zu verwenden, die nur eine einzige Linie der Modifikation mit Nickase-Varianten einführen kann, so dass ein kompensatorisches sgRNA-Paar zur Einführung eines doppelten Linienbruchs erforderlich ist, Alternativ kann die DNA-Bindungsenergie von Cas9 verändert werden, wodurch hochpräzise Cas9-Varianten wie SpCas9-HF, SpCas9-NG, evoCas9 und Cas9_R63A/Q768A entstehen. Diese entwickelten Cas9-Varianten haben eine geringere Kapazität zur Modifizierung von nicht übereinstimmenden Stellen, wodurch die Zielspezifität erheblich verbessert und die Target-Spaltung aufrechterhalten wird.

Optimales Führungsdesign: Es gibt mehrere Elemente von sgRNA, die die Spezifität beeinflussen können, wie die 10-12 bp Samensequenz, GC-Gehalt und Abschneiden am 5′ Ende, und nicht alle sgRNAs produzieren eine effiziente und spezifische Editierung. Wissenschaftler haben Computerplattformen entwickelt, die in der Lage sind, Leitsequenzen bereitzustellen, die in Bezug auf das zu untersuchende Gen optimiert sind, wie E-Crisp, CRISPR-Design und CasOFFinder, die Algorithmen verwenden, die aus phänotypischen Screening-Daten generiert wurden. Zuletzt verwendete sgDesigner eine Bibliothek von Siliziumplasmiden, um Effizienzdaten zu bearbeiten, anstatt sich auf variable phänotypische Screening-Ergebnisse zu verlassen. Das sgDesigner-Tool hat bisherige Tools übertroffen und verspricht eine robustere Plattform für das Guide-Design zu sein.

Verbessertes Targeting mit alternativen Cas-Proteinen: Cas9 von S. pyogenes ist das am häufigsten verwendete Cas9-Protein, das die 3′-NGG’5′ Protospacer Adjacent Motif (PAM) -Stelle erkennt. Seine große Größe macht es jedoch schwierig, in AAV-Vektoren für die Gentherapie zu verpacken. Kleinere Cas9-Alternativen wie S. aureus Cas9 (SaCas9) erfordern eine längere PAM, wodurch die Anzahl der für die Gen- und Zelltherapie verfügbaren Zielstellen reduziert wird. Die Sp-Cas9-NG- und xCas9-Varianten wurden entwickelt, um mit einer großen MAP-Anforderung kleiner zu sein.12,13 Aber die neue SpRY-Variante von Cas9 wurde entwickelt, um NRN und NYN zu erkennen.Es wurden auch zielgerichtete Cas9-Varianten entwickelt, einschließlich SpyCas9 und Cas13d, die eine Gen-Editierung bieten können, ohne einen Double Break einzuführen.

Reduzierung der DNA-Schädigungstoxizität mit Basis- und Core-Editoren: I tassi di efficienza dell’editing per la ricombinazione omologa (HDR) sono bassi, spesso soggetti a errori e l’introduzione di una doppia rottura nel DNA può indurre l’apoptosi delle cellule, un problema di sicurezza significativo per le applicazioni cliniche. Un recente progresso è stato lo sviluppo della tecnologia di editing delle basi, che utilizza una nickasi Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) collegata a una deaminasi per facilitare l’editing di un singolo nucleotide senza indurre la tossicità del danno al DNA. Più recentemente, è stato sviluppato l’editing primario, in cui una nickasi Cas9 è coniugata a una trascrittasi inversa – insieme a un RNA guida per l’editing primario (pRNA) contenente la modifica richiesta – il sistema di editing primario può „cercare e sostituire“ le modifiche desiderate, fornendo così un editing genico di precisione con un’attività fuori bersaglio significativamente ridotta.

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CRISPR-THERAPIE: Vermeidung des GMP-sgRNA-Engpasses

Aber CRISPR in die Klinik zu bringen ist teuer und zeitaufwendig: Die Behandlung von Sichelzellenerkrankungen kostet bis zu 2 Millionen US-Dollar für einen einzelnen Patienten. In der präklinischen Entdeckungsphase werden die verwendeten CRISPR-Reagenzien nur für Forschungszwecke (RUO) verwendet. Die Verfügbarkeit, Flexibilität und Zugänglichkeit von sgRNAs für die Forschung ermöglicht es, agil zu sein und schnell Proof-of-Concept für CRISPR-basierte Therapien zu etablieren. Der Übergang in die Klinik erfordert jedoch die Entwicklung und Implementierung von GMP-Qualitätsreagenzien (Good Manufacturing Practice), um die Rückverfolgbarkeit, Sicherheit, Reinheit und Wirksamkeit dieser Produkte zu gewährleisten. Der Übergang von RUO zu GMP sgRNA kann kompliziert sein und ohne richtige Planung kann der Übergang von der Entdeckung zur Prozessentwicklung von erheblichen Engpässen begleitet werden. Eine gute Möglichkeit, einen reibungslosen Übergang zu gewährleisten, besteht darin, sicherzustellen, dass die Lieferanten von CRISPR-Reagenzien über die Kapazität und Erfahrung verfügen, um Reagenzien in GMP-Qualität herzustellen.

Die Zukunft der CRISPR-Therapien ist da

Seit Doudna und Charpentiers bahnbrechender Arbeit vor über einem Jahrzehnt hat CRISPR die Genbearbeitung revolutioniert und bietet spannende Möglichkeiten für die Zell- und Gentherapie. CRISPR kann verwendet werden, um DNA-Sequenzen in vivo und ex vivo zu bearbeiten, um eine Reihe von genetischen Erkrankungen zu behandeln, sowie um Zellen zu modifizieren, um sie zu reparieren oder ihre Funktion zu verbessern, zum Beispiel durch Modifizieren von T-Zellen, um ihre Wirksamkeit bei der Bekämpfung von Krebs zu erhöhen. Es gibt immer noch Einschränkungen, aber die exponentielle Entwicklung der Technologie ermöglicht schnelle Abhilfelösungen und bietet eine potenzielle Behandlung für viele menschliche Krankheiten.

Wichtige Punkte, an die man sich erinnern sollte

  • Genbearbeitungstechnologien wie CRISPR-Cas9 sind vielversprechend für klinische Anwendungen, da genetische Modifikationen in situ durchgeführt werden können, wodurch die Zugabe von genetischem Material an potenziell unerwünschten Stellen im Genom vermieden wird.
  • CRISPR-basierte Therapien spielen eine Rolle in mehreren Studien zur Gen- und Zelltherapie, die derzeit in verschiedenen therapeutischen Bereichen durchgeführt werden.
  • Die CRISPR-Cas9-Technologie hat immer noch Einschränkungen, aber der schnelle Fortschritt der CRISPR-Technologie bedeutet, dass bereits mehrere Minderungslösungen entwickelt werden, einschließlich Cas9-Proteinen, die modifiziert wurden, um die Off-Target-Aktivität zu reduzieren, Design-Tools zur Auswahl optimaler sgRNAs, und Kern- und Primäreditoren, um die Toxizität von DNA-Schäden zu reduzieren.
  • Die Einführung von CRISPR in der Klinik erfordert eine Verlagerung von reinen Forschungsreagenzien (RUO) auf GMP-Qualitätsreagenzien (Good Manufacturing Practice), was kompliziert sein kann. Aber die Zusammenarbeit mit etablierten und erfahrenen Lieferanten kann den Übergang reibungslos gestalten.

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