Southern Blotting Techniken

Southern Blotting Techniken

Southern Blotting ist eine grundlegende Technik in der Molekularbiologie. Es wurde zuerst 1975 von E.M. Southern erfunden, als eine wichtige Methode zur Übertragung von DNA-Molekülen, insbesondere von Restriktionsfragmenten, von einem Elektrophoresegel auf eine Nitrocellulose- oder Nylonfolie, die normalerweise als Membran bezeichnet wird.

Während des Prozesses wird das im Gel vorhandene DNA-Bandmuster auf der Membran repliziert. Nach der Nachbehandlung wird die DNA auf der Membran immobilisiert und kann als Substrat für die Hybridisierungsanalyse mit markierten DNA- oder RNA-Sonden verwendet werden, die auf einzelne Restriktionsfragmente in der blotted DNA abzielen.

Ziel der Vorbehandlung ist es, die DNA-Moleküle in einzelnen Bändern innerhalb des Gels in kleinere Fragmente aufzubrechen, da kleinere Fragmente schneller als größere übertragen werden. Daher wird das Gel zuerst 30 Minuten lang in 0,25 mol L-1 HCL eingeweicht. Zweitens wird die Vorbehandlung mit einer alkalischen Lösung durchgeführt, um die doppelsträngigen DNA-Moleküle zu denaturieren, indem sie ihre Wasserstoffbindungen brechen, so dass sie einzelsträngig werden. Dies unterstützt auch ihre Übertragung und anschließende Bindung an die Membran. Darüber hinaus stellt es sicher, dass nach der Bindung die Basispaarungskomponenten der Polynukleotide für die Hybridisierung zur Sonde zur Verfügung stehen.

Gelelektrophorese ist eine Technik in der biologischen Wissenschaft, Gele werden verwendet, um alle Arten von Molekülen zu trennen, einschließlich DNA. Das Agarosegel ist das am häufigsten verwendete in der südlichen Analyse.

Es ist ein Polysaccharid, das eine lose Matrix bildet, wenn es mit Wasser erhitzt wird. Ein Stück Agarose wird erhitzt und durch Erhitzen von ca. 1g Agarosepulver in 100ml salzhaltiger Lösung bestehend aus 40mM-Tris-acetat, 1mM-EDTA, pH 8,0 hergestellt. Die heiße Mischung wird dann in eine rechteckige Form gegossen und stehen gelassen. An einem Ende wird ein Well-Former platziert, um kleine Schlitze im Gel zu erzeugen. Das Gel wird dann in einem speziellen Behälter mit Elektroden an beiden Enden platziert und vollständig in die Kochsalzlösung eingetaucht. Die mit dem Restriktionsenzym vorbehandelte DNA wird in die Rillen gelegt und der Tank an eine Stromversorgung angeschlossen, die eine kontrollierte elektrische Versorgung zum Antrieb der Elektrophorese bereitstellt. Die DNA-Fragmente haben eine negative Ladung, so dass sie beginnen, durch das Gel in Richtung des positiven Terminals zu migrieren. Schließlich werden die DNA-Fragmente in einer Spur des Gels mit den größeren Fragmenten an einem Ende und den kleineren Fragmenten an dem anderen verteilt. Es ist wichtig, DNA-Fragmente mit einer Mutation zu identifizieren, die das Leben eines Fötus ernsthaft beeinträchtigen könnte.

Um die DNA aus dem Gel zu entfernen, wird ein Stück dünnes Nitrocellulose-Filtermaterial auf das Gel gelegt, das auf einem Docht sitzt, der in der salzhaltigen Lösung getränkt ist. Ein Stapel Löschpapier wird auf den Filter gelegt und ein Gewicht wird darauf gelegt. Das Gewicht drückt nach unten auf den Stapel und die Kochsalzlösung beginnt, sich durch das Gel und auf das Löschpapier zu bewegen, während es die DNA-Fragmente zieht. Die Fragmente haften an der Oberfläche des Filters. Dies wird für einige Stunden durchgeführt, um sicherzustellen, dass die gesamte DNA vom Gel abgewaschen wird. Während dieser Technik wird ein Filter erhalten, der die gesamte DNA hat, die ursprünglich im Gel enthalten war, in der genauen Form, in der es sich befand, während es sich im Gel befand. So ähnelt das Verfahren einer Löschung einer Tintensignatur, daher der Begriff Southern Blotting.

In einer anderen Technik, wie dem Vakuumtransfer, wird die DNA unter Vakuum aus dem Gel entfernt und auf ein extrem zähes Filtermaterial aus Nylon gelegt, das jedoch weniger zerbrechlich ist als Nitrocellulose. Der Nylonfilter bindet sowohl DNA als auch DNA-Fragmente, so dass viele verschiedene Analysen der gebundenen DNA möglich sind. Mit dieser Technik ist es jedoch nicht einfach festzustellen, ob es Mutationen im DNA-Gen gibt.

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