Kultur und Pflege von Stammzellen

Stammzellen – von gesunden Spendern oder Patienten – werden oft in der Grundlagenforschung, Wirkstoffforschung und therapeutischen Anwendungen verwendet, aber ihre Kultivierung kann schwierig sein. Dieser Artikel gibt Tipps zur Kultivierung von Stammzellen im Labor, um reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten.

Unter den richtigen Bedingungen erhalten Stammzellen ihren Stammzellstatus (Selbsterneuerung) aufrecht oder differenzieren entlang eines bestimmten Weges. Diese Zellen stammen aus Quellen, die vom Embryo bis zum Bindegewebe reichen, oder können durch die Ausdifferenzierung bereits begangener Linien entstehen.

Für praktische Zwecke können die meisten Stammzellen in zwei Typen unterteilt werden: adulte Stammzellen und pluripotente Stammzellen (PSCs), bemerkt James Chen, CEO von ScienCell. Die letztere Kategorie umfasst embryonale Stammzellen (ESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). ‚Diese Zellen verwenden im Grunde die gleichen Kulturbedingungen‘, erklärt Chen.

Feed me : Stammzellkultur

„Stammzellkultur ist eine Kunst, und wir stecken noch in den Kinderschuhen“, sagt Lindy O’Clair, BioAnalytics Reagents and Consumables Manager, Product Management BioAnalytics Workflows, Sartorius. „Es ist wichtig, die Qualität des Ausgangsmaterials zu berücksichtigen. Das Verständnis der Reagenzien und ihrer Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit von Zellkulturen sowie die Kultivierung in zuverlässigen Geräten ermöglicht es, zuverlässige und reproduzierbare Daten zu erhalten.“

Historisch wurden PSCs auf einer Schicht von Feederzellen gezüchtet, normalerweise mitotisch inaktivierte Fibroblasten, eine Technik, die heute noch verwendet wird. Diese Feederzellen lieferten nicht nur eine physikalische Stützmatrix, sondern konditionierten das Kulturmedium auch mit (manchmal nicht identifizierten) Wachstumsfaktoren, die für die Entwicklung der Stammzellen und ihre Aufrechterhaltung in einem undifferenzierten Zustand notwendig sind. Neben Reproduzierbarkeitsproblemen hat das Feederzellensystem einige Nachteile, darunter die Tatsache, dass es arbeitsintensiv ist und die Fütterungsoberfläche im Voraus vorbereitet werden muss. Es kann zu gemischten Kulturen führen, die schwer zu trennen sind. Darüber hinaus besteht bei Interspezies-Fütterung (Mausfibroblasten zum Beispiel mit humanen PSCs) die Gefahr einer Pathogenübertragung.

Nicht-Saatkulturen sind einfacher und weniger zeitaufwendig einzurichten und zu warten, reproduzierbarer, leichter skalierbar und leiden nicht unter den möglichen Fallstricken von Co-Kulturen.

In Abwesenheit einer Feederzellschicht haften PSCs jedoch nicht an üblichen Gewebekulturoberflächen. Eine breite Palette von Matrizen, die normalerweise von extrazellulären Matrixproteinen (ECM) abgeleitet oder nachgeahmt werden, allein oder in Kombination, werden als physikalische Stützen sowohl für (relativ) flache als auch für dreidimensionalere Kulturen verwendet. Forscher können die Kulturplatten entweder selbst mit der Matrix ihrer Wahl bei der gewünschten Verdünnung beschichten, je nachdem, welchem Protokoll sie folgen, oder vorbeschichtete Kulturplatten kaufen.

In Abwesenheit von Feederzellen wurde das konditionierte Medium durch ein definiertes Stammzellmedium ersetzt, das auf der Pionierarbeit von James Thomson von der University of Wisconsin basiert. Mehrere Unternehmen bieten jetzt ähnliche kommerzielle Medien für den Anbau von PSCs an, erklärt Chen: ‚Dies sind im Wesentlichen DMEM/ F12 und Ergänzungen‘, die wichtigste Ergänzung ist der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF).

Wachsende iPSCs

Obwohl es einige ausgewählte Lieferanten gibt, von denen iPSCs bezogen werden können, isolieren die meisten Menschen ihre eigenen – es gibt viele gute Protokolle, die von Kollegen und online verfügbar sind , kommentiert Chen.

Die resultierenden Zelllinien können je nach einer Reihe von Faktoren voneinander abweichen, gemäß dem ATCC-Leitfaden zur Stammzellkultur: Tipps und Techniken für Stammzellkulturen. Dazu gehören die Genetik, der genomische Fingerabdruck und die Kulturbedingungen sowie die Methode zur Dedifferenzierung (Reprogrammierung) der Zellen in einen pluripotenten Zustand.

Aber es gibt fast universelle Methoden zur Pflege von PSCs.

Ein paar Tipps

Kulturen sollten täglich untersucht werden. Achten Sie insbesondere auf morphologische Veränderungen, was bedeuten kann, dass Zellen differenzieren – weniger als 10% der Zellen sollten sich differenzieren. Undifferenzierte PSCs entwickeln sich als kompakte Kolonien mit einem hohen Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis und prominenten Kernen. Die kleinen Kolonien können anfangs locker erscheinen, werden aber enger, wenn sie wachsen. Da Kolonien dazu neigen, sich beim Wachsen zu stapeln und zu überlappen, erscheinen ihre Zentren in der Regel hell.

Zellen, die Anzeichen von Differenzierung zeigen, und solche, die nicht angebracht sind, sollten entfernt werden – eine gute Möglichkeit, dies zu tun, besteht darin, den Bereich zu markieren und sie mit einer 200-Mikroliter-Spitze am Ende einer Saugpipette abzusaugen.

Das Medium sollte jeden oder zwei Tage komplett gewechselt werden (je nachdem, wen man fragt).

Konfluenz überwachen. Zellen sollten übertragen werden, wenn sie etwa 80% Konfluenz oder nach etwa fünf Tagen erreichen. Behandeln Sie die Kulturen sorgfältig, entweder mit einer enzymfreien Methode (mit einem Chelatbildner wie EDTA oder EGTA) oder einer milden Enzymlösung wie Accutase, um die Zellen von der Platte zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gruppiert bleiben (eine geringere Wahrscheinlichkeit der Differenzierung) und minimieren Sie das Pipettieren der Zellen während der Passage. ROCK-Inhibitor sollte verwendet werden, wenn sich Zellen von der Passage oder dem Auftauen erholen (aber nicht bei einfachen Medienwechseln erforderlich).

Während der Passage sollten die Zellen im Verhältnis 1:4 geteilt und in Klumpen mit kaltem Stammzellengefriermedium mit einer Rate von einem Grad pro Minute eingefroren werden.

Wissen, was Sie haben

Die Morphologie kann je nach Kulturbedingungen und Zellzustand variieren. Viele Forscher verlassen sich auf Pluripotenz-Marker-Panels, um den Status ihrer Zellen zu überprüfen, betont O’Clair – ein zeitaufwändiger und teurer Prozess, der das Opfern von Zellen erfordert (funktionelle Assays, bei denen Stammzellen zur Differenzierung in stärker beeinträchtigte Phänotypen induziert werden, sind dies noch mehr). Sie „freut sich auf das Aufkommen von Technologien, die den Zustand der Stammzellkultur genau identifizieren und beurteilen können“.

„Andere“ Stammzellen

Adulte Stammzellen – sich selbst erneuernde, aber nicht fixierte multipotente Zellen, die aus somatischem Gewebe isoliert wurden – sind eine attraktive Alternative zu PSCs, betont John Ludlow, Vizepräsident der regenerativen Medizin bei Zen-Bio. Der Rohstoff kann im Wesentlichen unbegrenzt sein, und ihre Kultur ist oft weit weniger empfindlich – oft in gewöhnlichem Gewebekulturmaterial, wobei handelsübliche Standardkulturmedien und Wachstumsfaktoren verwendet werden, die im fötalen Rinderserum enthalten sind. Je nach Quelle können sie – teilweise oder vollständig – über ausgewählte Signalwege in beispielsweise Adipozyten oder Neurozyten, Monozyten oder Hepatozyten differenziert werden.

‚Adulte Stammzellen und ihre Nachkommen können verwendet werden, um zum Beispiel Materialien wie Enzyme zu erzeugen‘, sagt Ludlow. ‚Sie können für funktionelle Assays verwendet werden und sind pharmakologisch agonisiert oder antagonisiert, um diese Funktion zu modulieren. Sie können über Membranen migriert oder in Tierstudien verwendet werden, um ihr Toxizitätsprofil zu untersuchen.

Stammzellen jeder Art – pluripotent, adulte, sogar krebsartige oder noch zu entdeckende – werden unweigerlich für eine Vielzahl von Anwendungen genutzt, die von einem besseren Verständnis der grundlegenden Biologie, Gesundheit und Krankheit bis hin zur Linderung oder Heilung von Krankheiten reichen. Diese Zellen zu züchten und zu erhalten, ist zwar eine Kunst, aber keine Raketenwissenschaft.

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